骨髓间充质干细胞颈内动脉移植治疗血管性痴呆大鼠的实验研究

【摘要】背景与目的成年哺乳动物的神经元缺乏再生能力，中枢神经系统(centralneuralsystem，CNS)损伤后的修复相当困难。目前人们将精力集中在干细胞移植治疗脑和脊髓病变上[1-6]。胚胎干细胞移植是治疗CNS疾病最有希望的手段之一[7-8]，但其受取材困难、免疫排斥和伦理学等因素的限制[9]。骨髓间充质干细胞（BoneMesenchymalstemcells，BMSCs）是具有高度自我更新、活跃增殖和多向分化潜能的干细胞[10-11]，其取自自体，抗原表达弱，引起的免疫排斥和移植物抗宿主反应低，且来源丰富，取材简便，易于体外分离、纯化和培养，并增殖速度快，能够满足细胞移植所需数量，具有广泛的科研和临床应用价值。BMSCs在体外适当的条件下经培养诱导后高表达神经细胞特异性标志物，如nestin、β-tubulinⅢ、MAP2、GFAP、NeuN等[12]，并定向分化为神经元和神经胶质样细胞[13-20]；且在脑外伤、脑血管疾病、中枢神经系统变性疾病等方面取得了一定的效果[2-3，21-26]。血管性痴呆(vasculardementia，VD)是由各种脑血管因素导致脑组织损害引起的智能障碍综合征，严重影响中老人的健康，发病率逐年上升，至今尚无特效疗法。因此，积极开展BMSCs移植治疗VD的基础与临床研究意义深远。本研究将BrdU标记的BMSCs经颈内动脉输注入VD大鼠体内，观察BMSCs透过血脑屏障(bloodbrainbarrier，BBB)在脑实质内存活、迁移和分布情况，并观察大鼠行为和认知功能、脑组织病理结构变化，同时探讨BMSCs对脑内周围生长相关蛋白-43（Growthassociatedprotein-43，GAP-43）、海马区细胞凋亡和胆碱能系统以及血清神经元特异性烯醇酶(Neuronspcificenolase，NSE)与S-100蛋白含量的影响，阐明颈内动脉移植BMSCs对VD大鼠神经功能恢复的可行性和有效性。方法1．BMSCs的提取、分离、培养和扩增采用淋巴细胞密度梯度分离法和贴壁法。2．BMSCsBrdU标记在加入20ng/mLNGF、RA基础上，加入BrdU使浓度为5μmol/L，在37℃、5%CO2饱和湿度的培养箱内培养诱导分化48h。3．实验动物分组随机分对照组(n＝126)、模型组(n＝126)和治疗组(n＝126)；又分2、4、8W三个时相点。4．动物模型改良的Pulsinellis四血管阻断法建立VD模型。治疗组于术后24h颈内动脉输入BMSCs，浓度为1.2×107/mL，注射剂量0.5mL。5．脑组织内BMSCs检测采用S-P免疫组化法检测BMSCs在脑内的存活、迁移及其分布特点。6．脑组织内GAP-43和海马区（Cholineacetyltransferase，ChAT）表达采用S-P免疫组化法。7．海马凋亡细胞检测采用TdT介导的dUTP缺口末端标记（TerminaldeoxynucleotidyltransferasemediateddUPTnickend－labelling，TUNEL）法。8．海马区乙酰胆碱（Acetylcholine，Ach）含量和乙酰胆碱脂酶（Acetylcholinesterase，AchE）活性检测采用Hestrin碱性羟胺比色法。9．血清NSE和S-100蛋白水平检测采用酶联免疫吸附法(Enzyme-linkedimmunoadsordentassay，ELISA)。10．行为学检测运用主动回避反应(activeavoidancereaction，AAR)检测学习、记忆能力。11．病理学观察光学显微镜和透射电子显微镜观察大鼠脑组织病理变化。结果1．BMSCs培养24h后细胞贴壁，3~4天进入对数增长期，呈集落样生长，形成多个克隆团样结构；10d左右80%~90%融合，下层为梭形和多角形的成纤维细胞，体积较大，约占90%左右，另有较少的小圆形多形细胞，折光率较高。传代后细胞生长潜伏期短，增殖迅速，呈梭形或扁平，排列规则，为漩涡状或流线形生长。BMSCs诱导30min后胞体变小，胞质向核周收缩，由梭形变成圆形，折光性增强，伸出轴突样突起，发出树突样次级分支，类似神经元样细胞，并与相邻的细胞胞体或突起相连，形成类似网络的联系；随着诱导时间的延长，96.7%分化成神经元样细胞。2．BMSCs在脑实质中广泛分布，富含血管区域多，围绕血管周围；主要迁移聚集至海马、大脑皮质等区域，并有局灶聚集现象。术后2W治疗组大鼠脑内可见较多BrdU免疫阳性细胞（4151±320），4W后有所减少（2818±186），8W仅见少量存活（92±19）。3．术后2、4、8W时，治疗组大鼠脑内GAP-43阳性细胞数较模型组明显增多（P＞0.01）。4．术后2、4、8W时，模型组大鼠海马区TUNEL阳性细胞比例显著高于对照组（P﹤0.01）。术后2W时治疗组大鼠海马区TUNEL阳性细胞比例显著高于对照组（P﹤0.05），4、8W时明显下降，与对照组无显著差异（P﹥0.05）。术后2、4、8W时治疗组大鼠海马区TUNEL阳性细胞比例均显著低于模型组(P<0.01)。5．术后2、4、8W时，模型组和治疗组大鼠海马ChAT阳性细胞数均显著低于对照组(Ｐ<0.05)，但治疗组均显著高于模型组(Ｐ<0.05)。6．与对照组比较，模型组大鼠海马Ach含量和AchE活性明显降低(P<0.01)；与模型组比较，治疗组Ach含量和AchE活性明显升高(P<0.01)。7．术后2W时模型组大鼠血清NSE含量最高，明显高于对照组(P＜0.01)；4W时有所下降，与对照组比较无显著差异(P＞0.05)，8W时降至最低，明显低于对照组(P＜0.01)。术后2W时治疗组大鼠血清NSE含量明显低于模型组(P＜0.05)，4、8W时则明显高于模型组(P＜0.05)，而与对照组比较无显著差异(P＞0.05)。8．术后2、4、8W时，模型组大鼠血清S-100蛋白含量明显高于对照组(P＜0.05)；术后2、4、8W时治疗组大鼠血清S-100蛋白含量均明显低于模型组(P﹤0.01或P﹤0.05)，但与对照组比较均无显著差异(P＞0.05)。9．术后2、4、8W时，模型组大鼠AAR比率均明显低于对照组，差异非常显著(P＜0.01)，而治疗组亦明显低于对照组，但均高于模型组，差异也非常显著(P＜0.01)。10．各组大鼠脑组织病理学改变：模型组呈缺血缺氧性弥漫性损伤，以大脑皮质区及海马为主；部分细胞核可见固缩、碎裂、溶解、变性、坏死或脱失，胞浆致密，炎细胞浸润。治疗组神经细胞变性、坏死数量明显减少，程度减轻。结论1．BMSCs颈内动脉移植可透过VD大鼠BBB迁移聚集在脑缺血易损伤部位存活，使脑内GAP-43、海马ChAT阳性细胞表达显著增多。表明BMSCs可促进神经元轴突修复、再生，有利于胆碱能神经元分化、生长和突触功能的重建。2．颈内动脉移植BMSCs后，治疗组VD大鼠海马区细胞凋亡比例显著低于模型组。表明BMSCs对于保护VD大鼠脑海马神经细胞，减少细胞凋亡有较好的作用。3．BMSCs治疗后VD大鼠神经细胞变性、坏死数量减少，程度明显减轻；结合海马区Ach含量、AchE活性以及血清NSE、S-100蛋白水平检测结果，表明BMSCs可明显改善VD大鼠胆碱能系统功能，有效减轻神经元、胶质细胞的损伤程度，对神经细胞修复、增殖及突触联系起到良好的保护作用。4．颈内动脉移植BMSCs可显著改善VD大鼠的学习记忆能力。
【作者】王昌铭；
【导师】滕军放；
【作者基本信息】郑州大学，神经病学（专业学位），2014，博士
【关键词】骨髓间充质干细胞；血管性痴呆；颈内动脉；移植；主动回避反应；凋亡；周围生长相关蛋白-43；胆碱乙酰转移酶；乙酰胆碱脂酶；乙酰胆碱；神经元特异性烯醇化酶；S-100蛋白；

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